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β-葡萄糖醛酸酶发酵培养条件优化及提取研究
来源:互联网 sk006 | 王振强,胡爱军
【分  类】 基础科学
【关 键 词】 β-葡萄糖醛酸酶;发酵;培养条件;优化;提取
【来  源】 互联网
【收  录】 中文学术期刊网
正文:

  摘要:β-葡萄糖醛酸酶(β-G)是大肠杆菌(E.coli)的特异酶,本文利用酶-底物法测定β-G活性,确定了β-G的最佳发酵培养基:胰蛋白胨 1%、淀粉 5%、Nacl 0.5%、酵母膏 0.5%、pH 7.2~7.4;最佳发酵培养条件:通气量 50ml/250ml三角瓶,转速 110rpm,并用硫酸铵分级沉淀法对β-G进行提取研究。

  关键词:β-葡萄糖醛酸酶;发酵;培养条件;优化;提取

  食品卫生和食品安全关系到人民群众的身体健康和生活质量,关系到我国经济发展和社会稳定的一件大事[1]。β-G是一种酸性水解酶,特异地富含于大肠杆菌中,国外早在八十年代初开始将β-G的检出用于判断大肠杆菌的存在,该法具有快速、特异性强、价格低廉、灵敏度高等优点,不仅用于大肠杆菌的快速定性检测,还可达到定量检测。大肠杆菌作为一种危害性较强的致病菌,对于人类的身体健康构成了很大的威胁,因此大肠杆菌快速检测对于保障人类的身体健康具有重要的意义[2]。

  1材料与方法

  1.1 材料

  大肠杆菌 天津公安医院;蛋白胨 天津英博生化试剂有限公司;琼脂条 北京化学试剂公司;琼脂粉 日本进口分装;酵母浸膏 天津英博生化试剂有限公司;甘油磷酸钠 中国医药上海化学试剂公司;无水葡萄糖 天津市北辰液化化学试剂厂;胰蛋白胨 北京双旋微生物培养基制品厂;硫酸铵 天津天大化工实验厂;乙醇 天津天大化工实验厂;磷酸 天津四通化工厂;考马斯亮蓝G-250 Amresco公司;对硝基酚-β-D-葡萄糖醛酸苷 天津市医药科学研究所。

  1.2仪器与设备

  蒸汽消毒器 山东新华医疗器械厂; YP型电子天平 上海天平仪器厂;752分光光度计 上海光谱仪器有限公司;TG328A分析天平 上海天平仪器厂;95-1磁力搅拌器 上海司乐仪器厂;HYG-II回转式恒温调速摇瓶柜 上海欣蕊自动化设备有限公司;LSY电热恒温水浴锅 北京医疗设备厂;PHSJ-4A型pH酸度计 美国奥立龙公司;BS-自动部分收集器 上海沪西分析仪厂;BT00-300M流量调节器 保定兰格恒流泵有限公司;LRH-250-A生化培养箱 广东省医疗器械厂。

  1.3 方法

  1.3.1大肠杆菌生长曲线的测定

  1.3.1.1 接种

  取大肠杆菌斜面培养基1支,以无菌操作挑取适量菌苔(两环),接入种子培养液中。

  1.3.1.2校正零点

  将蒸馏水倾倒入比色皿中,选用650nm波长分光光度上调节零点,以作测定的空白对照。

  1.3.1.3测零时OD值

  将刚接入大肠杆菌的但未振荡培养的培养基倾倒入比色皿中,在校好零点的分光光度计上测定O.D值。此时的O.D值即为接种后大肠杆菌生长曲线中的零时读数值。

  1.3.1.4 振荡培养

  将接过种的三角瓶放入自控恒温汽浴摇床上振荡培养,温度为37℃,转速110rpm。

  1.3.1.5 生长量测定

  在培养过程中,每隔2小时从摇床上取下一瓶装有培养基的三角瓶,将培养基倒入比色皿中,并在分光光度计上读取OD值。

  1.3.2 β-葡萄糖醛酸酶提取

  将E.coli振荡培养6小时至酶活高峰,停止培养,按下面工艺进行提取[4]。

  2 结果与讨论

  2.1大肠杆菌生长曲线的测定

  实验将E.coli接种于种子培养基中以培养时间为横坐标,测得的OD值为纵坐标,绘制E.coli生长曲线如图1。

  图1 E.coli的生长曲线

  Fig 1 The growth curve of E.coli

  从图1可以看出0~4小时为迟缓期,4~10小时为对数生长期,10小时以后,菌体的生长进入稳定期。

  2.2 β-葡萄糖醛酸酶活性测定

  2.2.1 底物选择

  天津医药科学研究所于2000年合成了对硝基酚-β-葡萄糖醛酸苷(PNPG),纯度与Sigma公司PNPG相比略高,且价格不足Sigma公司价格的十分之一,因而选择PNPG为底物。

  2.2.2 测定原理[5]

  β-葡萄糖醛酸酶

  对硝基苯基-β-葡萄糖醛酸苷钠盐 对硝基酚 +β-葡萄糖醛酸苷钠盐

  大肠杆菌所具有的葡萄糖醛酸酶水解对硝基苯基-β-葡萄糖醛酸苷钠盐,游离出的对硝基酚呈黄色,可用分光光度计在405nm波长处测定。

  2.3β-葡萄糖醛酸酶活性测定

  2.3.1 发酵培养基的优化

  2.3.1.1 碳源的选择

  原发酵培养基:酵母膏0.5%、蛋白胨1%、Nacl 0.5%、pH 7.2~7.4,121℃灭菌20min。在原发酵培养基的基础上,选用淀粉、甘油磷酸钠和葡萄糖作为碳源,添加量为5%;发酵液 50ml/250ml 三角瓶。37℃水域振荡培养(110rpm),于6小时取样检测,结果见图2。

  1260

  377

  20

  0

  200

  400

  600

  800

  1000

  1200

  1400

  淀粉

  甘油磷酸钠

  葡萄糖

  酶活(U)

  图2 碳源对产酶的影响

  Fig2 The influence of Carbon source Producing enzyme

  由图2可以看出淀粉为该菌产酶的最佳碳源,甘油磷酸钠次之,对葡萄糖的利用能力较差。在实验中,淀粉的成本较低,选取添加量为5%的淀粉作为优化后的碳源。

  2.3.1.2 氮源的选择

  原发酵培养基:酵母膏0.5%、淀粉5%、Nacl 0.5%、pH 7.2~7.4,121℃灭菌20min。在原发酵培养基的基础上,选用蛋白胨、胰蛋白胨和大豆蛋白作为氮源,添加量为1%、发酵液 50ml/250ml 三角瓶。37℃水域振荡培养(110rpm),于6小时取样检测,结果见图3。

  图3 氮源对产酶的影响

  Fig 3 The influence of Nitrogen source Producing enzyme

  由图3可以看出胰蛋白胨是比较适合该菌产酶的氮源。 在实验中,选取添加量为1%的胰蛋白胨作为优化后的氮源。

  通过实验可得优化发酵培养基:酵母膏0.5%、胰蛋白胨1%、Nacl 0.5%、淀粉5%、pH 7.2~7.4。

  2.3.2 发酵培养条件的选择

  2.3.2.1通气量对产酶的影响

  在250ml三角瓶中分别装入30ml、50ml、70ml优化发酵培养基,按2%的接种量接种。于110 rpm旋转水域摇床37℃振荡培养,在6小时取样,4℃下离心,转速为3000rpm,离心15 min,除去菌体。用对硝基酚-β-葡萄糖醛酸酐酶底物法测上清的酶活力见图4。

  图4 通气状况对产酶的影响

  Fig 4 The influence of Ventilation conditions Producing enzyme

  由图4可以看出,发酵液体积越大,即通气量越小时,发酵液中酶活力越高,但它们彼此之间相差不是很明显。发酵选择50ml/250ml瓶的装液量。

  2.3.2.2 摇床转速对产酶的影响

  在250ml三角瓶中装入50ml优化发酵培养基,按2%的接种量接种。分别于110 rpm、170 rpm、210 rpm旋转水域摇床37℃振荡培养。在6小时取样,4℃下离心,转速为3000 rpm ,离心15 min,除去菌体。用对硝基酚-β-葡萄糖醛酸酐酶底物法测上清的酶活力见图5。

  图5 摇床转速对产酶的影响

  Fig5 The influence of Rotation speed Producing enzyme

  由图5可以看出,转速的改变对产酶的影响不是很明显,,选择110 rpm旋转水域摇床37℃振荡培养。

  通过实验可得优化发酵培养条件为:发酵选择50ml/250ml瓶的装样量,110 rpm旋转水浴摇床37℃振荡培养。

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